色谱方法学验证.docx

所谓方法验证（validation，又叫认证）就是要证明所开发方法的实用性和可靠性。实用性一般指所用仪器配置是否全部可作为商品购得（实验室自己制造的仪器部件就欠实用），样品处理方法是否简单易操作，分析时间是否合理，分析成本是否可被同行接受等。可靠性则包括定量的线性范围、检测限、方法回收率、重复性、重现性和准确度等。下面就简单讨论这几个可靠性参数。

1.方法的线性范围即检测器响应值与样品量（浓度）成正比的线性范围，它主要由检测器的特性所决定。原则上。这一线性范围应覆盖样品组分浓度整个变化范围。线性范围的确定通常是采用一系列（多于3个）不同浓度的样品进行分析，以峰面积（或峰高）对浓度进行线性回归。当相关系数大于0.99时，就可认为足线性的，小于0.99时，就超出了线性范围。一个好的GC定量方法，其线性范围（以FID检测器为例）可达10;,线性相关系数等于或大于0.9999。

2.方法的检测限检测限（DL）是指方法可检测到的最小样品量（浓度）。一般的原则是按照3倍信噪比计算，即气样品组分的响应值等于基线噪声的3倍时，该样品的浓度就被作为最小检测限，与此对应的该组分的进样量就叫做最小检测量10次，统汁待测组分的保留时间和峰面积（或峰高）的RSD,一般要求保留时间的RSD不大于1%,峰面积的RSD不大于5%。文献报道的最佳重复性数据为保留时间的RSD小于0.1%，峰面积的RSD小于1%。如果样品要经过预处理，还应测定同一样品多次处理的重复性。即同一样品取35份做平行处理，看最后测定结果的重复性。这一RSD值应不大于5%。当然，有些工业分析要求不大于10%即可。至于天与天之间的重现性也不应大于10%、当上述重复性满足要求后，说明该方法在你的实验室是可靠的。要将此方法作为标准方法推广使用，还必须测定不同仪器、不同实验室之间的重现性。当这些重现性（RSD）都能满足要求时。这一方法的可靠性就得到了较为满意的验证。方法的线性关系及检测限准确称取7种目标物的标准品，用甲醇稀释配制成7种目标物的标准溶液，根据需要用甲醇分别稀释配制成5级标准工作溶液，浓度范围如表3所示，在选定的色谱条件下，分别进样分析。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作回归方程，结果见表3,回归方程的相关系数R2均大于0.9999,线性关系良好。以最低浓度标样重复进样5次，取其3倍标准偏差为检测限，10倍标准偏差为定量限，根据样品处理过程将结果换算为ug/g，得到该方法的检测限和定量限方法的回收率和重复性采用标准加入法测定方法的回收率。取一种已知目标物含量的样品（7#），加入与其含量相当的混合标准溶液，重复5次,测定其加标回收率和重复性，结果如表5所示。5次重复实验的RSD范围为1.3%

3.1%，回收率范围为9.70%

8.96%，可以满足定量需要。引自RP-HPLC法测定烟用香精香料中的7种防腐剂内标法方法学注意事项（引自网页论坛）选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物（当然是样品中没有的组分），然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将内标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。用内标法公式计算即可。内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。选择内标物有4个要求：

1.内标物应是该试样中不存在的纯物质；

2.它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离；

3.加入内标物的量应接近于被测组分；

4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。内标法的优点是测定的结果较为准确，由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。内标法的缺点是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。外标法简便，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。那么内标法的方法学研究就是将过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值，也就是一个比值，来进行一些精密度、准确度、线性之类的研究。具体就是配制不同浓度的标准溶液，记录样品和内标峰面积，计算样品/内标峰面积比值R样品/内标，利用样品浓度C对比值R样品/内标作直线回归，得回归方程，作为标准曲线。精密度、准确度也如此。首先你要了解何为内标法内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。化学方面的因素包括：

1、内标物在样品里混合不好；

2、内标物和样品组分之间发生反应

3、内标物纯度可变等。对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题（如渗漏）对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定，在用内标法做色谱定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件（如固定相、柱温、载气流速等），还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2,曲线仍可使用，若大于2,则应重作曲线，如果曲线在皎短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。所以，当你确定应用内标法之后，就不需要进行这些实验的。因为你在加内标时它就是一个已知浓度了。做方法学的时候，内标和待测物标准品（比如你的白三烯待测物）要分别单独进样，然后再做标液的色谱图（含有内标和样品），然后再是提取或者回收后的样品（如血浆或者一些细胞，组织提取物等等），最后比较两者的封面积。如果内标选择用来做方法回收率的，在样品前处理前进行添加。如果你在做标准曲线时候则上机前添加，添加量不管外标是否为梯度内标量是固定的。你看到有人做实际样品时候只是在上机前添加内标，他这时候的内标不能指示回收率，只能用于校正仪器信号偏差，通俗的说这种内标叫上机内标。而前处理时候加入的内标叫替代内标。（我这是个人称呼，不是官方称呼哈）。添加内标的量，一般要是样品含量的两倍，这个，其实很难把握吧，样品含量我们也不知道，所以就大胆的去加就行了。嘿嘿，纯个人观点哈！